Fluorestsentsfilter on fluorestsentsmikroskoobi oluline komponent. Tüüpilisel süsteemil on kolm põhifiltrit: ergastusfilter, emissioonifilter ja dikroiline peegel. Tavaliselt pakitakse need kuubikusse, nii et rühm sisestatakse koos mikroskoopi.
Kuidas fluorestsentsfilter töötab?
Ergastusfilter
Ergastusfiltrid edastavad kindla lainepikkusega valgust ja blokeerivad teisi lainepikkusi. Neid saab kasutada erinevate värvide tootmiseks, häälestades filtrit nii, et läbi pääseks ainult üks värv. Ergastusfiltreid on kahte peamist tüüpi - kaugpääsfiltrid ja ribapääsfiltrid. Erguti on tavaliselt ribapääsfilter, mis läbib ainult fluorofoori neeldunud lainepikkusi, minimeerides seega teiste fluorestsentsiallikate ergastamist ja blokeerides ergastusvalguse fluorestsentsi emissiooniribas. Nagu joonisel sinine joon näitab, on BP 460–495, mis tähendab, et see suudab läbida ainult fluorestsentsi 460–495 nm.
See asetatakse fluorestsentsmikroskoobi valgustusrada ja filtreerib välja kõik valgusallika lainepikkused, välja arvatud fluorofoori ergastusvahemik. Filtri minimaalne ülekanne määrab piltide heleduse ja sära. Iga ergastusfiltri puhul on soovitatav vähemalt 40% ülekanne, et ideaaljuhul oleks üle 85%. Ergastusfiltri ribalaius peaks jääma täielikult fluorofoori ergastusvahemikku, nii et filtri kesklainepikkus (CWL) oleks võimalikult lähedal fluorofoori ergastuse lainepikkusele. Ergastusfiltri optiline tihedus (OD) määrab taustapildi tumeduse; OD on mõõt selle kohta, kui hästi filter blokeerib lainepikkusi väljaspool edastusvahemikku või ribalaiust. Soovitatav on minimaalne OD 3,0, kuid ideaalne on OD 6,0 või suurem.
Heitgaasi filter
Emissioonifiltrite eesmärk on võimaldada proovi soovitud fluorestsentsil jõuda detektorini. Need blokeerivad lühemaid lainepikkusi ja neil on suurem läbilaskvus pikemate lainepikkuste jaoks. Filtri tüüp on seotud ka numbriga, nt joonisel BA510IF (häirebarjääri filter), mis viitab lainepikkusele 50% selle maksimaalsest ülekandest.
Samad soovitused ergastusfiltrite kohta kehtivad ka emissioonifiltrite kohta: minimaalne edastus, ribalaius, OD ja CWL. Ideaalse CWL-i, minimaalse ülekande ja OD kombinatsiooniga emissioonifilter pakub võimalikult eredaid pilte, sügavaima võimaliku blokeeringuga ja tagab nõrgimate emissioonisignaalide tuvastamise.
Dikroiline peegel
Dikroonne peegel asetatakse ergastusfiltri ja emissioonifiltri vahele 45° nurga all ning peegeldab ergastussignaali fluorofoori suunas, edastades samal ajal emissioonisignaali detektori poole. Ideaalsetel dikroonilistel filtritel ja kiirejaoturitel on teravad üleminekud maksimaalse peegelduse ja maksimaalse ülekande vahel, peegeldus >95% ergutusfiltri ribalaiusest ja ülekanne >90% emissioonifiltri ribalaiusest. Valige filter fluorofoori lõikumislainepikkust (λ) silmas pidades, et minimeerida hajutatud valgust ja maksimeerida fluorestsentspildi signaali-müra suhet.
Sellel joonisel olev dikroiline peegel on DM505, mis on nimetatud seetõttu, et 505 nanomeetrit on selle peegli lainepikkus 50% maksimaalsest ülekandest. Selle peegli ülekandekõver näitab suurt läbilaskvust üle 505 nm, järsu läbilaskevõime langust 505 nanomeetrist vasakule ja maksimaalset peegelduvust vasakul 505 nanomeetrit, kuid siiski võib läbilaskvus olla väiksem kui 505 nm.
Mis vahe on kaugpääs- ja ribapääsfiltritel?
Fluorestsentsfiltrid võib jagada kahte tüüpi: pikkpääs (LP) ja ribapääs (BP).
Pikapääsfiltrid edastavad pikki lainepikkusi ja blokeerivad lühemad. Lõigatud lainepikkus on väärtus 50% tipu ülekandest ja kõik lainepikkused, mis ületavad sisselõiget, edastatakse kaugpääsfiltrite kaudu. Neid kasutatakse sageli kahevärvilistes peeglites ja emissioonifiltrites. Pikkpääsfiltreid tuleks kasutada siis, kui rakendus nõuab maksimaalset emissiooni kogumist ja kui spektraalne eristamine ei ole soovitav või vajalik, mis tavaliselt kehtib sondide puhul, mis tekitavad suhteliselt madala tausta autofluorestsentsi tasemega proovides ühe kiirgava liigi.
Ribapääsfiltrid edastavad ainult teatud lainepikkusriba ja blokeerivad teised. Need vähendavad läbirääkimist, võimaldades edastada ainult fluorofoori emissioonispektri tugevaimat osa, vähendavad autofluorestsentsmüra ja parandavad seega signaali-müra suhet kõrge taustaga autofluorestsentsproovides, mida pikapääsmefiltrid ei suuda pakkuda.
Mitut tüüpi fluorestsentsfiltrikomplekte suudab BestScope pakkuda?
Mõned levinumad filtritüübid on sinised, rohelised ja ultraviolettfiltrid. Nagu tabelis näidatud.
| Filtrikomplekt | Ergastusfilter | Dikroiline peegel | Barjääri filter | LED lamp Lainepikkus | Rakendus |
| B | BP460-495 | DM505 | BA510 | 485 nm | ·FITC: fluorestseeruvate antikehade meetod ·Acidiinoranž: DNA, RNA ·Auramiin: tuberkuloosibatsill ·EGFP, S657, RSGFP |
| G | BP510-550 | DM570 | BA575 | 535 nm | ·Rodamiin, TRITC: Fluorestseeruvate antikehade meetod ·Propiidiumjodiid: DNA · RFP |
| U | BP330-385 | DM410 | BA420 | 365 nm | · Auto-fluorestsentsi vaatlus ·DAPI: DNA värvimine · Hoechest 332528, 33342: kasutatakse kromosoomide värvimiseks |
| V | 400-410 BP | DM455 | BA460 | 405 nm | ·Katehhoolamiinid ·5-hüdroksütrüptamiin ·Tetratsükliin: skelett, hambad |
| R | BP620-650 | DM660 | BA670-750 | 640 nm | ·Cy5 · Alexa Fluor 633, Alexa Fluor 647 |
Fluorestsentsi kogumisel kasutatavad filtrikomplektid on kavandatud fluorestsentsrakendustes kasutatavate peamiste lainepikkuste ümber, mis põhinevad enimkasutatud fluorofooridel. Sel põhjusel on need saanud nime ka pildistamiseks mõeldud fluorofoori järgi, näiteks DAPI (sinine), FITC (roheline) või TRITC (punane) filtrikuubikud.
| Filtrikomplekt | Ergastusfilter | Dikroiline peegel | Barjääri filter | LED lamp Lainepikkus |
| FITC | BP460-495 | DM505 | BA510-550 | 485 nm |
| DAPI | BP360-390 | DM415 | BA435-485 | 365 nm |
| TRITC | BP528-553 | DM565 | BA578-633 | 535 nm |
| FL-Auramiin | BP470 | DM480 | BA485 | 450 nm |
| Texase punane | BP540-580 | DM595 | BA600-660 | 560 nm |
| mCherry | BP542-582 | DM593 | BA605-675 | 560 nm |
Kuidas valida fluorestsentsfiltrit?
1. Fluorestsentsfiltri valimise põhimõte on lasta fluorestsents-/emissioonivalgusel võimalikult kaugele läbida pildiotsa ja samal ajal täielikult blokeerida ergastav valgus, et saavutada kõrgeim signaali-müra suhe. Eriti mitmefotoni ergastuse ja täieliku sisemise peegeldusmikroskoobi kasutamisel põhjustab nõrk müra ka suuri häireid pildistamise efektile, seega on signaali ja müra suhte nõue kõrgem.
2. Teadma fluorofoori ergastus- ja emissioonispektrit. Kvaliteetse ja suure kontrastsusega musta taustaga kujutise genereeriva fluorestsentsfiltri komplekti koostamiseks peaksid ergastus- ja emissioonifiltrid saavutama kõrge ülekande minimaalse pääsuriba pulsatsiooniga piirkondades, mis vastavad fluorofoori ergastuse tippudele või emissioonidele.
3. Võtke arvesse fluorestsentsfiltrite vastupidavust. Need filtrid peavad olema läbilaskmatud intensiivsete valgusallikate suhtes, mis tekitavad ultraviolettvalgust (UV-valgust), mis võib põhjustada "läbipõlemist", eriti ergutifiltri puhul, kuna see on allutatud valgusallika täielikule intensiivsusele.
Erinevad fluorestseeruvad näidispildid
Ressursid kogutakse ja korrastatakse Internetis ning neid kasutatakse ainult õppimiseks ja suhtlemiseks. Rikkumise korral võtke meiega kustutamiseks ühendust.
Postitusaeg: 09. detsember 2022